（广州中医药大学中药学院,广东广州510006）
摘要:目的建立化橘红药材红外指纹图谱的聚类分析方法,为快速鉴别不同品种化橘红药材提供依据。方法采用傅里叶红外光谱法(FTIR)建立不同品种化橘红药材红外指纹图谱,并应用Spectrumv5.0.1红外软件和SPSS13.0统计分析软件处理实验数据,进行聚类分析。结果红外光谱法结合聚类分析鉴别不同品种化橘红药材正确率为92.9%。结论利用红外指纹图谱法结合聚类分析,可作为化橘红药材品种快速鉴别的一种新方法。关键词:化橘红;红外指纹图谱;聚类分析;鉴别
中图分类号:R927.2
文献标识码:A do:i10.3969/.jissn.1006 8783.2011.03.019
文章编号:1006-8783(2011)03-0284-0
化橘红是芸香科植物化州柚Citrusgrandis Tomentosa 或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟干燥外层果皮。前者习称“毛橘红”，后者习称“光橘红”,均有散寒、利气、消痰的功能,主要用于风寒咳嗽、喉痒痰多、食积伤酒、呕吐痞闷等 疾病[1] 。柚的栽培变种——外果皮密被绒毛的化州柚仅产于广东省化州市,其药材毛橘红曾被列为明清皇室祛痰镇咳贡品,为著名道地药材;而来源于柚的光橘红则产地甚广,质量较次。 以往化橘红的化学鉴别方法主要是薄层色谱 法,但由于化橘红、光橘红均富含柚皮苷,故难以区别;近年来,对化橘红药材化学鉴别研究的报道 有色谱指纹图谱法[2-3] ,但该法分离提取过程复杂,且色谱条件的建立耗时、费力。傅里叶变换红 外光谱分析法(FTIR)可快速鉴别药材[4-7] ,实用性强,笔者使用该法开展了不同品种化橘红药材的鉴别研究。
1 材料与方法
1-1 仪器 AVATAR360傅里叶变换红外光谱仪(美国NICOLET,DTGS检测器),ThermoNicoletEZOMNIC仪器系统操作软件,Spectrumv5.0.1红外应用软件(PerkinElmer公司);FW-4/4A型压片机(天津光学仪器有限公司);HF-2红外压片模具(天津光学仪器有限公司);BS110S电子分析天平(Sartorius);DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏);DFY-200摇摆式高速中药粉碎机(温岭大德中药机械公司);玛瑙研钵。
1-2 样品与试药 KBr(光谱纯);化橘红对照药材(编号121165-200502)购自中国药品生物制品检定所,为芸香科植 物柚Citrusgrandis(L.)Osbeck近成熟干燥外层果皮的粉末;毛橘红样品采自广东省化州市化橘红生产基地,光橘红样品采自广东省化州市化橘红生产基地或购自药店,详见表1。各样品均经广州中医药大学中药学院林励研究员鉴定,其中毛橘红基源为芸香科植物化州柚C.grandis Tomentosa,光橘红基源为芸香科植物柚C.grandis(L.)Osbeck,药材标本存放于广州中医药大学中药学院实验管理中心。
表1 化橘红药材来源、品种及采收期
编号 样品 来源及品种 采收或购买日期
F01 采于化州市平定镇化橘红GAP基地上天堂产区,毛橘红 2007年6月
F02 采于化州市平定镇化橘红GAP基地上天堂产区,毛橘红 2008年5月
F03 采于化州市平定镇化橘红GAP基地农中产区,毛橘红 2008年5月
F04 采于化州市平定镇化橘红GAP基地农中产区,毛橘红 2009年5月
FO5 采于化州市平定镇化橘红GAP基地大茶岭产区,毛橘红 2006年5月
F06 采于化州市平定镇化橘红GAP基地大茶岭产区,毛橘红 2008年5月
F07 采于化州市平定镇化橘红GAP基地大茶岭产区,毛橘红 2009年5月
F08 采于化州市平定镇化橘红GAP基地田子嶂产区,毛橘红 2006年5月
F09 采于化州市平定镇化橘红GAP基地田子嶂产区,毛橘红 2009年5月
F10 采于化州市平定镇化橘红GAP基地田子嶂产区,毛橘红 2008年5月
F11 采于化州市平定镇化橘红GAP生产基地,光橘红 2007年6月
F12 采于化州市平定镇化橘红GAP基地农中产区,光橘红 2007年6月
F13 购于广州中医药大学大药房饮片厂(产地广西),光橘红 2009年3月
F14 购于云南楚雄市延寿堂连锁店,光橘红 2003年1月
F15 购于山西太古中药饮片厂,光橘红 2003年2月
F16 购于广东揭阳汇康医药有限公司,光橘红 2003年1月
F17 购于广州致信中药饮片有限公司(产地广东),光橘红 2009年3月
F18 购于广州致信中药饮片有限公司(产地广东),光橘红 2006年9月
F19 购于广州致信中药饮片有限公司(产地广东),光橘红 2007年5月
F20 购于广州致信中药饮片有限公司(产地广东),光橘红 2009年9月
F21 购于广西玉林市鑫康药材有限公司(产地广西),光橘红 2008年12月
F22 购于广西玉林市鑫康药材有限公司(产地广东),光橘红 2008年12月
F23 购于江西赣州市赣县友邦大药房(产地广西),光橘红 2009年2月
F24 购于安徽丰原铜陵中药饮片公司(产地广东),光橘红 2009年1月
F25 购于湖南衡阳民生堂(产地广东),光橘红 2009年2月
F26 购于广州济和堂药业连锁长洲分店,光橘红 2008年3月
F27 购于广州采芝林药业有限公司,光橘红 2008年3月
F28购于广东国药医药有限公司天润分店(产地广西),光橘红 2009年1月
F29 购于中国药品生物制品检定所,光橘红对照药材 2010年6月
1-3 光谱条件与样品测定 样品分别在摄氏60度干燥至恒重,粉碎,过80目筛,备用。取样品粉末约2mg,精密称定,加入KBr约150mg,在红外线灯下混合研磨,均匀放入模具内,压强为16MPa时维持1min进行压片。光谱范 围4000~400cm-1 ,扫描信号累加32次(扣除H2O和CO2的干扰),分辨率4cm-1 。
1-4 方法学考察
1-4-1 精密度试验 取同一批号样品(F03)供试片连续测定5次,谱图间相关系数分别为1.0000、1.0000、1.0000、1.0000、0.9999,RSD=0.0447%。
1-4-2 重复性试验 于同一批号样品(F03)中取样5次,分别进行压片、依法测定,谱图间相关系数分别为1.0000、0.9991、0.9984、0.9979、0.9923,RSD=0.30%。
1-4-3 稳定性试验 取同一批号样品(F11)供试片放入干燥器内保存,分别放置0、1、2、3、4、24h后依法测定,所得谱图的相关系数分别为:1.0000、0.998、0.9988、0.9987、0.9997和0.9972,RSD=0.11%。
1-5 数据预处理 每个样品依法测定3~5次,然后将各次测得的光谱曲线加和取平均作为样品的平均谱图,所有谱图吸光度均选点归一化至1.5,对图谱作9点平滑以降低噪声的干扰。
2 结果与分析
2-1 不同品种化橘红药材红外光谱的构建及分析根据10批毛橘红样品和18批光橘红样品红外光谱图的平均光谱,构建两者的红外光谱图并进行分析。2种化橘红药材样品的红外光谱图如图1所示,两者红外行为高度相似,主要吸收峰的波数、形状基本一致,从直观上不易区分。
A.光橘红;B.毛橘红。
图1 不同品种的化橘红红外光谱图
2-2 不同品种化橘红药材红外光谱数据的聚类分析
2-2-1 聚类分析数据的提取 从图1中可知2种化橘红药材样品红外光谱图1800~800cm-1 波段范围内吸收峰的位置和峰强度差异较为明显,具有一定的特征性和指纹性,提取该波段的吸光度值作为模式识别的原始数据,导出29个化橘红样品(包括化橘红对照药材)红外光谱图的波数及相对应的吸光度,形成29 521数据矩阵,作为数据分析的基础。
2-2-2 聚类分析的结果 采用近邻法(nearestneighbor)选取欧氏距离平方和作为样品的测度,对化橘红药材粉末FTIR指纹图谱数据进行聚类分析,结果见图2。
F1~F28.表1中F1~F28样品;F29.化橘红对照药材。
图2 化橘红药材粉末的FTIR指纹图谱聚类图
以距离3.5划分,10个毛橘红样品(F1~F10)与2个光橘红样品(F11、F12)为一类;其他光橘红样品中F14、F15、F17、F18、F20、F21、F24、F25、F26、F27、F28为一类,F13、F16、F19、F22、F23、F29聚为一类。与性状鉴别法分类结果相比较,化橘红红外光谱聚类分析结果正确率为92.9%(仅F11、F12光橘红样品出现误判)。
3 讨论
对近邻法、远邻法、中位数法、重心法、Ward最小方差法、组间平均连接法、组内平均连接法7种聚类方法进行考察,发现采用近邻法聚类较理想。对1800~800cm-1、1200~600cm-1、1800~600cm-1波段范围数据进行考察比较,1800~800cm-1波段范围内2种化橘红药材样品吸收峰的位置和强度差异较为明显,并具有一定的特征性和指纹性,因此采集该段样本吸光度值作为模式识别的原始数据。聚类分析结果能反映出样品间的亲疏远近关系,聚为一类的样品在多维空间内的距离较接近,其红外光谱之间的相似性较好,即样品间的差异较小。道地药材毛橘红均产自广东省化州市平定镇,生长地区的气候、土壤等自然条件及加工程序可保持较高的一致性,药材质量水平较为一致,因而聚为一类。而光橘红聚类分析结果显示则相对较为分散,可能与药材产地较分散,生长地区的气候、土壤等自然条件及不同品种的化橘红产地加工等不同,从而导致质量水平差异较大有关。光橘红基源为柚,毛橘红基源为柚的栽培变种,两者为种与栽培变种的亲缘关系,其变异与产地应有密切相关。本文聚类分析结果显示,光橘红样品F11、F12与同样采自于化橘红GAP基地的毛橘红样品聚为一类,这是否与其长期种植于同一基地有关,值得进一步深入研究。本研究对化橘红药材红外指纹图谱进行聚类分析,从得到的聚类分析树状图上即可区分、鉴别毛橘红和光橘红,可用于化橘红药材及其粉末的品种快速鉴别。该法简便快捷、结果准确,适合大量样品的快速鉴别研究,有良好的科学性和实用性。
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